| 標(biāo)題：細(xì)胞與分子生物學(xué)論文：細(xì)胞死亡方式及其檢測方法 | ||
| 細(xì)胞與分子生物學(xué)論文：細(xì)胞死亡方式及其檢測方法 摘要：細(xì)胞因受嚴(yán)重?fù)p傷而累及胞核時(shí)，呈現(xiàn)代謝停止、結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失等不可逆性變化，此即細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡包括壞死和凋亡兩大類型。傳統(tǒng)的細(xì)胞死亡方式分類包括細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡2種，后者又稱為程序性細(xì)胞死亡。死亡的原因很多，一切損傷因子只要作用達(dá)到一定強(qiáng)度或持續(xù)一定時(shí)間，從而使受損組織的代謝完全停止，就會引起細(xì)胞、組織的死亡。近期又發(fā)現(xiàn)了很多細(xì)胞死亡的途徑，為了能夠?qū)?xì)胞死亡有更透徹的了解，我們可以從其檢測方法入手，反向地學(xué)習(xí)死亡途徑和方法，本文總結(jié)了最常用的檢測方法。 關(guān)鍵詞：細(xì)胞死亡，凋亡，壞死，檢測方法，DNA片段， Abstract：The traditional way of cell death classification includes cell necrosis and apoptosis, the latter also is known as programmed cell death, recently we have discovered a lot of cell death pathways, in order to be have a more thorough understanding, we can start with detection method so that have a good understanding of means of death. this article summarizes the most commonly used detection methods and will get a great help for our learning. Key words: cell death, Apoptosis, Necrosis, Detection methods, DNA fragments 長期以來, 細(xì)胞死亡方式分為 ……（快文網(wǎng)http://m.hoachina.com省略1405字，正式會員可完整閱讀）……
1.3凋亡和壞死的區(qū)別 為了更加徹底明白兩種死亡方式的不同，可以從兩種的不同特征做個(gè)比較。如表一 表一：細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的區(qū)別 特征 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死 誘發(fā)因素 特定的或生理性 各種病理性 細(xì)胞數(shù)量 單個(gè)細(xì)胞丟失 成群細(xì)胞死亡 質(zhì)膜 完整保持 腫脹溶解破裂 細(xì)胞核 固縮破裂為片段 溶解破裂 染色質(zhì) 凝集呈半月狀 模糊疏松 線粒體 腫脹通透性增加，細(xì)胞C釋放 腫脹破裂 細(xì)胞器 完整 損傷 內(nèi)含物釋放 無 有 炎癥反應(yīng) 無 有 核DNA 降解為完整倍數(shù)大小的片段 隨機(jī)不規(guī)則斷裂 凝膠電泳 梯狀條帶形 分散形態(tài) 2. 細(xì)胞死亡檢測方式 細(xì)胞死亡的方式可根據(jù)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞膜通透性及染色體變化情況，并可結(jié)合各種染色或標(biāo)記方法來確定。最常用的觀察方法是用光鏡、電鏡或共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞、細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞膜及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，并按目前大多數(shù)學(xué)者接受的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)加以鑒別。 2.1線粒體跨膜電位檢測法 線粒體膜電位是由線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子的不對稱分布而形成的電化學(xué)梯度， 在細(xì)胞凋亡過程中常因膜孔道大小的改變及轉(zhuǎn)膜電位的降低來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。在凋亡早期，當(dāng)線粒體形態(tài)學(xué)方面尚無明顯變化時(shí)，其膜電位已經(jīng)發(fā)生耗散。因此， 其膜電位的耗散被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，而且一旦線粒體膜電位耗散，凋亡就不可逆轉(zhuǎn)。但使用該方法時(shí)要始終保持平衡染液pH值的一致性。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如JC-1等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。但是要注意的是，除了在凋亡中出現(xiàn)線粒體去極化外，在脹亡中也可發(fā)生此現(xiàn)象。[8] 2.2 DNA片段檢測 細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死時(shí)，DNA發(fā)生斷裂，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片段。探測DNA 片段可用瓊脂糖凝膠電泳、酶聯(lián)免疫吸附法、TUNEL法及其它檢測方法如ISEL( insitu end labeling)、ISOL( Insituo ligo Ligation)。 2.2.1TUNEL法 TUNEL方法是通過檢測DNA 雙鏈斷裂暴露出的粘性3c-OH 末端來確定凋亡的經(jīng)典方法。在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，DNA的3c-末端與熒光素、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸結(jié)合，從而進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離出來的細(xì)胞，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。用光學(xué)顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察TUNEL檢測結(jié)果，陽性著色的為凋亡細(xì)胞[11]。TUNEL法標(biāo)記的是凋亡晚期階段的細(xì)胞，在此階段,細(xì)胞形態(tài)已經(jīng)明顯紊亂。雖然TUNEL 方法能識別發(fā)生凋亡的細(xì)胞，但是有時(shí)凋亡和壞死重疊，因此一些凋亡性細(xì)胞未染色。這使得在一些情況下會低估凋亡信息。而且，甲醛固定能妨礙TUNEL染色，被標(biāo)記的細(xì)胞和周圍正常細(xì)胞的對照性較差。在組織切片上難以確定準(zhǔn)確結(jié)果。TUNEL染色對凋亡來說不是特異的，在脹亡中也可以見到[12]。 2.2.2瓊脂糖凝膠電泳和酶聯(lián)免疫吸附法 凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180~200 bp DNA片段，而脹亡或壞死細(xì)胞DNA 斷裂點(diǎn)為無特征的彌漫性隨機(jī)片段，利用這些特征使用瓊脂糖凝膠電泳可以確定細(xì)胞的死亡方式。凋亡細(xì)胞經(jīng)電泳后出現(xiàn)階梯狀(DNA Ladder) 條帶；而脹亡或壞死細(xì)胞經(jīng)電泳后呈隨機(jī)性電泳條帶[9]。觀察DNA最常用的方法是利用熒光染料EB進(jìn)行染色。凝膠應(yīng)該在無EB情況下電泳, 電泳結(jié)束后用EB染色。但是要注意的是，在壞死中發(fā)生的蛋白水解途徑也能導(dǎo)致將DNA分裂為核小體間片段的酶激活，因此也可能出現(xiàn)DNA 階梯狀條帶，這與凋亡過程中見到的情況不能區(qū)別[10]。 凋亡細(xì)胞的DNA 斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體，核小體由組蛋白及DNA片段組成，可用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。 2.3組化染料 根據(jù)染料與細(xì)胞組分結(jié)合的不同分為細(xì)胞核染料、細(xì)胞膜染料和細(xì)胞質(zhì)染料。死亡的細(xì)胞和活的細(xì)胞與染料的親和性不同，在電鏡下觀察可以分辨出細(xì)胞的存活情況。 2.3.1細(xì)胞核染料 常用的細(xì)胞核染料有Hoechst、PI、DAPI、AO(acrid ine orange)和EB等方法。 2.3.1.1 Hoechst是一種不需要透化作用就可以穿透細(xì)胞膜并將DNA 染色的的藍(lán)色熒光染料[16]，是與DNA 特異結(jié)合的非細(xì)胞毒性活性染料，優(yōu)先與雙螺旋小溝外面的三個(gè)腺嘌呤和胸腺嘧啶堿基對結(jié)合[17]，既可染有活力的細(xì)胞又可染發(fā)生凋亡的細(xì)胞，常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡(在紫外光照明下)觀察或流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染，凋亡細(xì)胞的凝縮染色質(zhì)著色比正常細(xì)胞的染色質(zhì)更亮。 2.3.1.2 PI是一種核酸熒光染料，用作死亡或正在死亡細(xì)胞的一種標(biāo)志物，因?yàn)榇巳玖喜荒艽┩富罴?xì)胞的質(zhì)膜，而只穿過受損細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞[18]，所以在凋亡晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。PI染陽性、細(xì)胞核不凝聚或斷裂的細(xì)胞認(rèn)為是壞死性的[19]。 2.3.1.3 DAPI( 4c,6-d iam id ino-2-pheny lindo le) DAPI也是一種標(biāo)記細(xì)胞核的藍(lán)色熒光染料，能夠與DNA中大部分A、T堿基相互結(jié)合，因?yàn)镈API可以透過完整的細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。DAPI染色常用于細(xì)胞凋亡檢測。染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，利用紫外光激發(fā)，顯示染色體濃縮、核分成小裂片或斷裂。 2.3.1.4 AO為一種膜通透性活體染料，可區(qū)別正常和凋亡細(xì)胞核，在活細(xì)胞中，AO 可作為一種PH 指示劑，因?yàn)樗凰嵝詫影鼑鷷r(shí)會發(fā)出鮮亮的黃或橘紅色光。正常和凋亡性細(xì)胞核染色不同，正常PH 時(shí), AO將雙鏈核酸染為綠色，在凋亡過程中因?yàn)榧?xì)胞核酸化、PH 值降低而將凋亡細(xì)胞核染為黃或橘紅色。因此，AO已被用作識別凋亡細(xì)胞的染色方法，這種簡單的方法可靈活地附加到其它方法以識別和研究凋亡性細(xì)胞。如依次使用AO和EB染色，使用共聚焦顯微鏡觀察。EB不能穿透活細(xì)胞的質(zhì)膜，而只穿過受損的細(xì)胞膜進(jìn) ……（未完，全文共10114字，當(dāng)前只顯示3652字，請閱讀下面提示信息。收藏細(xì)胞與分子生物學(xué)論文：細(xì)胞死亡方式及其檢測方法） 上一篇：情景劇本：斷橋相逢 下一篇：加強(qiáng)紀(jì)檢監(jiān)察干部監(jiān)督工作講話稿 相關(guān)欄目：文教論文 綜合論文 |